肝脏是哺乳动物体内最具再生能力的器官之一，在经受各种损伤后仍然能够恢复其初始的质量和功能。其中最广为人知的是在切除部分组织后肝脏仍具有极强的再生能力，例如，当把小鼠肝脏的2/3部分切除后，它能够在1-2周内迅速恢复到受伤前大小以维持正常功能，这是临床上肝脏移植治疗的基础。肝脏的这种强大的再生能力，使得其成为研究组织再生的一个经典器官。目前有关肝脏再生的研究主要集中在肝脏损伤后的肝再生过程，主要采取手术损伤（如肝脏部分切除、胆管结扎等）和药物诱导损伤（如CCl4、CDE和DDC等）的方式来诱导肝脏再生。然而截止目前，怀孕期间母体肝脏逐渐增大的原因及分子机制却鲜有报道。
为了研究怀孕引发的母体肝脏增大这一过程的细胞起源，何灵娟团队主要从两个角度来研究：一个是细胞的肥大，另一个是细胞的增殖。这主要基于肝脏最主要的实质细胞——肝细胞的两个重要特性：1）成体肝脏中，约90%以上的肝细胞都是多倍体或多核细胞，肝细胞的体积可以通过倍性的增加或降低相应的增大和缩小；2）肝细胞本身具有一定的增殖能力，在肝细胞增殖能力不受损的情况下，肝脏主要靠肝细胞的增殖来维持稳态更新和损伤修复过程。
以往研究检测肝细胞大小的方法主要是通过切片染色来计算平面内每个肝细胞的面积，这种方法的准确性较低。细胞是一个立体的结构，每个切面切到细胞的不同层面计算出细胞的面积不同，并不能准确评估细胞的大小。为了解决这一问题，何灵娟团队采用了评估细胞体积的方法，他们构建了能够特异性标记所有肝细胞的细胞膜的工具小鼠，同时结合组织透明化技术和双光子深度成像，清晰地获得了每个肝细胞的轮廓，可以准确地计算肝细胞体积。
研究结果表明，怀孕后肝细胞体积发生了显著的增大。研究还发现肝脏内肝细胞的体积并不是均一的，而这与肝脏的基本结构和功能单位肝小叶的结构密切相关。肝小叶中的肝细胞由于代谢功能和基因表达等的不同具有较大的异质性，从肝门静脉区到肝中央静脉区大体可分为三区：Zone 1, Zone 2, Zone 3。研究结果显示肝小叶中Zone 2 肝细胞的体积最大，Zone 1 和Zone 3 肝细胞体积较为接近，怀孕后，三个分区的肝细胞体积都显著增大，并且怀孕后仍然是Zone 2肝细胞的体积最大。
为了研究肝细胞增殖对怀孕后母体肝细胞增大的贡献，研究人员采用了前期建立的能够在体内长时间不间断记录细胞增殖的遗传工具—ProTracer，结合肝细胞特异性表达的AAV-Dre驱动ProTracer, 在整个孕期监测肝细胞增殖。研究结果发现，绝大部分的肝细胞在怀孕后都发生了细胞增殖，有意思的是，肝细胞的增殖并不是随机或者同步的，而是呈现出了一种独特的时空动态变化过程，即从怀孕早期到晚期，肝细胞增殖逐渐从Zone 1转移到Zone 2 再转移到Zone 3 这样一个过程。此外还发现，每个分区肝细胞对怀孕后肝脏增大的贡献并不相同，其中Zone 2肝细胞贡献最多，Zone 3贡献最少。

Zone 2肝细胞不仅在孕期发挥着重要的作用，也是肝脏在稳态维持中最主要的新生细胞来源。然而，与Zone 1 (E-CAD⁺) 和Zone 3 (GS⁺) 肝细胞具有特异性的标记基因不同，Zone 2 肝细胞一直缺少特异性的标记基因以及相应的遗传示踪工具。为了能够特异性地标记和追踪Zone 2 肝细胞，以进一步对该群细胞进行深入研究，研究人员首先对小鼠肝脏进行了单细胞转录组测序研究，发现Ccnd1在Zone 2肝细胞中高度富集，进一步通过免疫荧光染色确认其编码的蛋白Cyclin D1主要表达在E-CAD和GS双阴性的Zone 2 区域。但是，除了表达在肝细胞中，Cyclin D1还在胆管细胞等非肝细胞中表达，这就使得仅仅依赖于Ccnd1的遗传工具无法特异性地标记Zone 2 肝细胞。为了解决这个问题，研究人员引入了基于Cre-loxP和Dre-rox的双同源重组酶系统，通过特异性示踪肝细胞的遗传工具与基于Ccnd1的遗传工具的交集，实现了特异性地标记Zone 2肝细胞 （图）。Zone 2 肝细胞工具建立后，研究人员在小鼠孕期特异性追踪了这群肝细胞的变化，发现Zone 2 肝细胞在怀孕后显著扩增，揭示了Zone 2 肝细胞对怀孕后母体肝脏增大的重要贡献。Zone 2 肝细胞工具的建立，不仅对孕期肝脏增大的研究具有重要的作用，也为整个肝脏再生领域的研究提供了非常重要的遗传工具。

那么到底什么原因促使了孕期母体肝脏的增大呢？研究人员把目光聚焦到了性激素上面。怀孕后，母体内性激素水平发生了剧烈的变化，其中雌激素变化非常明显，在怀孕后显著升高。为了探究雌激素是否会促进肝细胞增殖，研究人员将雌激素直接注射到成年雌鼠体内，发现雌激素能够显著诱导肝脏增大，并诱导大量肝细胞增殖，其中Zone 2肝细胞增殖的比例最高，这与自然怀孕过程肝脏增大的效果非常接近，说明雌激素在怀孕后肝脏增大的过程中具有重要作用。
无论是自然怀孕还是雌激素诱导，增殖最多的肝细胞都集中在Zone 2，到底是什么机制调控了Zone 2 肝细胞的增殖优势特性？研究人员推测Cyclin D1可能在这里面发挥重要作用，因为Cyclin D1本身是一种细胞周期调控蛋白，并高度富集在Zone 2肝细胞中。为了验证Cyclin D1是否对Zone 2肝细胞的增殖具有重要作用，研究人员利用Ccnd1 flox小鼠在肝细胞中特异性的敲除了Ccnd1，结果发现，肝细胞特异性敲除Ccnd1后，怀孕和雌激素诱导的肝细胞增殖均被显著的抑制，证实了Cyclin D1对Zone 2肝细胞增殖的重要调控作用。
综上，该研究通过多种独特的遗传工具揭示了怀孕后母体肝脏增大的细胞起源和调控机制，发现肝细胞增大和增殖均对该过程具有重要贡献，为理解孕期肝脏变大的机理提供了重要信息。同时建立了首个能够特异性示踪肝细胞重要亚群Zone 2的遗传示踪工具，为肝脏再生研究提供了强有力的遗传工具，有助于推动肝脏发育和再生的深入研究。

西湖大学生命科学学院何灵娟课题组2021级博士生何顺、助理研究员郭志侯、原科研助理周明姗为该论文共同第一作者，何灵娟研究员为该论文通讯作者。该工作得到了中国科学院分子细胞卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究员的大力支持。